氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）在氮循环过程中扮演着重要角色，二者均可将氨（NH3）氧化为亚硝酸盐（NO2-）。羟胺是AOB氨氧化过程的重要中间产物，以欧洲亚硝化细菌（Nitrosomonas europaea）为例（图1），NH3被氨单加氧酶（AMO）氧化成羟胺，接着被羟胺氧化还原酶（HAO）氧化为亚硝酸盐。AOA的氨氧化底物和产物与AOB过程相同，但是AOA的基因组中没有编码HAO的基因，那么羟胺是否也是AOA氨氧化的中间物呢？5 o2 A! g% N; x) a$ E- [
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5 k: H+ H$ ]0 d$ O) W' {图1 AMO: 氨单加氧酶；heme: 血红素；HAO: 羟胺氧化还原酶。- D! V/ C- @* P0 r! N/ n
( B- ~/ ?) s9 D5 }由于羟胺不稳定，需要可靠的实验来证明这个假设。如果羟胺是AOA氨氧化的中间产物，则AOA一定可以氧化羟胺，那么给AOA培养基中加入羟胺之后，一定是有亚硝酸盐产生的。据此，Neeraja Vajrala等人做出如下对照实验：通过控制其它培养条件，在不同组的AOA培养基里分别加入50 μM、200 μM、1 mM的羟胺和200 μM的NH4+。如图2所示，以羟胺和NH4+为底物都有亚硝酸盐的产生。( O6 D( A h1 _3 |) a }5 V
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" ~# ^- u, R; G5 O9 T7 ^图2
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, r# }1 L, a5 g8 ~" q, g. @3 X为了增加说服力，Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验：两个实验组的底物分别为200 μM的NH4+和200 μM的羟胺，然后统计两个实验组分别在加入0.1%的乙炔、2.5 mM的ATU（丙烯基硫脲）和空白对照条件下亚硝酸盐的生成量。结果如图3所示，0.1%的乙炔和2.5 mM的ATU都能有效抑制AMO的活性从而阻断NH4+氧化过程，但是AOA仍然可以氧化羟胺，说明羟胺的氧化过程与AMO的活性无关。
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6 M0 ~- C5 R+ N7 B/ e5 ~, e L图3 带有正方形、三角形、圆形的曲线分别对应对照组、加入0.1%乙炔、加入2.5mM的ATU 横轴代表时间，纵轴代表培养基中亚硝酸盐浓度。, }) S) e& v# @. Q! y
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综合上述两个实验可以确定AOA可以氧化羟胺，那此过程是否是其氨氧化的一部分呢？Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验，如图4所示，a为在ATU和乙炔存在的条件下加入NH4+和羟胺之后氧气的消耗情况，可以看到在只有NH4+作为底物时，氧气含量不变，在加入羟胺之后，氧气的含量呈线性下降。b为在NH4+存在的情况下加入ATU而后加入羟胺过程的氧气消耗，在加入ATU之前氧气含量呈线性下降，加入ATU之后，氧气含量不再变化，加入羟胺之后，氧气含量继续下降。该实验证明了AOA氧化羟胺需要氧气的参与。
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5 U( f' L4 h3 x$ J# }) t* Y) l图4 横轴代表时间，纵轴代表培养基中氧气浓度，箭头代表加入对应试剂。) d- e9 O* X# z
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为了进一步验证羟胺的氧化是否与理论相符，Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验。如图5所示，羟胺消耗量:氧气消耗量:亚硝酸盐生成量近似等于1:1:1，实验结果表明AOA氧化羟胺的过程是与理论上的羟胺氧气氨三者的比例是吻合的。
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( M7 a9 E8 L& K! t, o! B" f为了验证羟胺的氧化与ATP的合成相关联，Neeraja Vajrala等人设计了另外一个实验，在培养体系中加入ATP合成抑制剂CCCP（氧化磷酸解偶联剂）。如图6所示，对比图6A和图6B，可以发现加入CCCP后底物为NH3的实验组几乎不产生亚硝酸盐，而底物为羟胺的实验组的亚硝酸盐生成量显著减少。此结果证明了羟胺的氧化与ATP的合成有关，换言之羟胺氧化是释放能量的过程。 t! D# y9 ?. O- y
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除此之外，该实验还有一个有意思的发现，对比图6A和图6B中活细胞实验组的ATP和亚硝酸盐的产生情况，生成等量亚硝酸盐时，底物为羟胺的培养基中的ATP含量远高于底物为NH3的培养基中的ATP含量，由此可以推断，氧化NH3到羟胺是消耗ATP的过程，而从图6B中加入CCCP和不加入CCCP亚硝酸盐的生成量不难看出， 在ATP顺利产生的情况下羟胺的氧化效率更高。
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, ?' V+ u: d7 l" L9 m$ W图5 正方形代表氧气吸收，对应左侧纵轴；圆形代表羟胺消耗，三角形代表亚硝酸盐生成，这二者对应右侧纵轴。横轴代表时间。
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图6 白色为不加底物，灰色为加入NH4+作为底物，黑色为加入羟胺作为底物。横轴代表活细胞，加入CCCP的活细胞和加热杀死的细胞。A的纵轴代表培养基中ATP的含量，B的纵轴代表培养基中亚硝酸盐的含量。6 ^- U5 U% i0 r0 z% u5 `5 N6 c$ o
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上述几个实验证明，类似于AOB，羟胺的氧化是AOA氨氧化过程的关键步骤，若是能证明AOA会将氨氧化为羟胺，则可以进一步证实羟胺是AOA氨氧化的中间物。
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采取实验的方法很难验证氨氧化生成成羟胺，首先因为羟胺的合成和转化同时进行，其次还因为羟胺氧化过程的酶在AOA中是未知的，无法有效阻断这一步酶催化过程。另外，羟胺非常不稳定，难以直接检测。于是Neeraja Vajrala等人采取了气相色谱法（GC）来分离物质，用同位素比质谱分析（IR-MS）的方法追踪氨氧化的中间产物。如图7A所示，加入15N标记的NH4+后，15NH2OH浓度逐渐上升，代表AOA在利用加入的15NH4+生成15NH2OH，而加入乙炔后，15NH2OH的浓度与羟胺的浓度呈相同的速率减少，这说明乙炔阻断了15NH4+到羟胺的转化。如图7B所示,加入15NH4+后，15NO2-的含量逐渐上升，表明AOA利用了15NH4+生成15NO2-，而在加入乙炔之后，15NO2-的生成逐渐停止而非立刻停止，这说明由NH3到NO2-的转化并非一步反应，其中间产物随时间减少。AB对照即可得出，羟胺为AOA氨氧化的中间产物。5 E9 M% ~/ |; y: j1 u
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. e* b( }8 @! i图7 A:底物为羟胺，虚线代表培养基中羟胺的浓度,对应左侧纵轴；实线表示含有同位素标记的羟胺浓度，对应右侧纵轴，横轴代表时间。B: 底物为NH4+，虚线代表培养基中亚硝酸盐浓度，对应左侧纵轴；实线代表含同位素标记的亚硝酸盐含量对应右侧纵轴，横轴代表时间。
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原标题：PNAS：羟胺是海洋中氨氧化古菌（Nitrosopumilus maritimus）氨氧化过程的中间产物
. `& `8 G# |+ J J作者：张翮， 杨玉春 微生物氮循环' X) H* N2 k$ P/ c+ G1 y; p" ]3 w
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