前沿关注 羟胺是海洋中氨氧化古菌氨氧化过程的中间产物 [复制链接]

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京东
氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)在氮循环过程中扮演着重要角色,二者均可将氨(NH3)氧化为亚硝酸盐(NO2-)。羟胺是AOB氨氧化过程的重要中间产物,以欧洲亚硝化细菌(Nitrosomonas europaea)为例(图1),NH3被氨单加氧酶(AMO)氧化成羟胺,接着被羟胺氧化还原酶(HAO)氧化为亚硝酸盐。AOA的氨氧化底物和产物与AOB过程相同,但是AOA的基因组中没有编码HAO的基因,那么羟胺是否也是AOA氨氧化的中间物呢?4 H  R  k/ z2 S2 H0 ]1 D
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5 g& f' a" t" L& M3 c图1 AMO: 氨单加氧酶;heme: 血红素;HAO: 羟胺氧化还原酶。
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4 l  A8 Z5 }% ]9 H' b9 }由于羟胺不稳定,需要可靠的实验来证明这个假设。如果羟胺是AOA氨氧化的中间产物,则AOA一定可以氧化羟胺,那么给AOA培养基中加入羟胺之后,一定是有亚硝酸盐产生的。据此,Neeraja Vajrala等人做出如下对照实验:通过控制其它培养条件,在不同组的AOA培养基里分别加入50 μM、200 μM、1 mM的羟胺和200 μM的NH4+。如图2所示,以羟胺和NH4+为底物都有亚硝酸盐的产生。
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9 a$ M- T* r! p- B) i# ~1 b为了增加说服力,Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验:两个实验组的底物分别为200 μM的NH4+和200 μM的羟胺,然后统计两个实验组分别在加入0.1%的乙炔、2.5 mM的ATU(丙烯基硫脲)和空白对照条件下亚硝酸盐的生成量。结果如图3所示,0.1%的乙炔和2.5 mM的ATU都能有效抑制AMO的活性从而阻断NH4+氧化过程,但是AOA仍然可以氧化羟胺,说明羟胺的氧化过程与AMO的活性无关。/ _) A; a. {# G4 e

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/ a; {" T0 n9 f% F# U  g( f& _图3 带有正方形、三角形、圆形的曲线分别对应对照组、加入0.1%乙炔、加入2.5mM的ATU 横轴代表时间,纵轴代表培养基中亚硝酸盐浓度。" R$ n- \# s/ [
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综合上述两个实验可以确定AOA可以氧化羟胺,那此过程是否是其氨氧化的一部分呢?Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验,如图4所示,a为在ATU和乙炔存在的条件下加入NH4+和羟胺之后氧气的消耗情况,可以看到在只有NH4+作为底物时,氧气含量不变,在加入羟胺之后,氧气的含量呈线性下降。b为在NH4+存在的情况下加入ATU而后加入羟胺过程的氧气消耗,在加入ATU之前氧气含量呈线性下降,加入ATU之后,氧气含量不再变化,加入羟胺之后,氧气含量继续下降。该实验证明了AOA氧化羟胺需要氧气的参与。
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图4 横轴代表时间,纵轴代表培养基中氧气浓度,箭头代表加入对应试剂。
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% W" M1 M# u* `2 x* I/ q, a% _/ z为了进一步验证羟胺的氧化是否与理论相符,Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验。如图5所示,羟胺消耗量:氧气消耗量:亚硝酸盐生成量近似等于1:1:1,实验结果表明AOA氧化羟胺的过程是与理论上的羟胺氧气氨三者的比例是吻合的。
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为了验证羟胺的氧化与ATP的合成相关联,Neeraja Vajrala等人设计了另外一个实验,在培养体系中加入ATP合成抑制剂CCCP(氧化磷酸解偶联剂)。如图6所示,对比图6A和图6B,可以发现加入CCCP后底物为NH3的实验组几乎不产生亚硝酸盐,而底物为羟胺的实验组的亚硝酸盐生成量显著减少。此结果证明了羟胺的氧化与ATP的合成有关,换言之羟胺氧化是释放能量的过程。! g  W1 k' ?0 d- s( u1 y

% R8 j% d# h+ G- z$ u. [9 E0 ~- w除此之外,该实验还有一个有意思的发现,对比图6A和图6B中活细胞实验组的ATP和亚硝酸盐的产生情况,生成等量亚硝酸盐时,底物为羟胺的培养基中的ATP含量远高于底物为NH3的培养基中的ATP含量,由此可以推断,氧化NH3到羟胺是消耗ATP的过程,而从图6B中加入CCCP和不加入CCCP亚硝酸盐的生成量不难看出, 在ATP顺利产生的情况下羟胺的氧化效率更高。
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图5 正方形代表氧气吸收,对应左侧纵轴;圆形代表羟胺消耗,三角形代表亚硝酸盐生成,这二者对应右侧纵轴。横轴代表时间。3 g% u+ ?& f$ m' C! ?
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" l. [3 |# u6 s8 z图6 白色为不加底物,灰色为加入NH4+作为底物,黑色为加入羟胺作为底物。横轴代表活细胞,加入CCCP的活细胞和加热杀死的细胞。A的纵轴代表培养基中ATP的含量,B的纵轴代表培养基中亚硝酸盐的含量。
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上述几个实验证明,类似于AOB,羟胺的氧化是AOA氨氧化过程的关键步骤,若是能证明AOA会将氨氧化为羟胺,则可以进一步证实羟胺是AOA氨氧化的中间物。- L; U$ G3 ^2 V) W9 x6 @) ?3 m

+ R! }6 f5 H- i( }2 l9 }采取实验的方法很难验证氨氧化生成成羟胺,首先因为羟胺的合成和转化同时进行,其次还因为羟胺氧化过程的酶在AOA中是未知的,无法有效阻断这一步酶催化过程。另外,羟胺非常不稳定,难以直接检测。于是Neeraja Vajrala等人采取了气相色谱法(GC)来分离物质,用同位素比质谱分析(IR-MS)的方法追踪氨氧化的中间产物。如图7A所示,加入15N标记的NH4+后,15NH2OH浓度逐渐上升,代表AOA在利用加入的15NH4+生成15NH2OH,而加入乙炔后,15NH2OH的浓度与羟胺的浓度呈相同的速率减少,这说明乙炔阻断了15NH4+到羟胺的转化。如图7B所示,加入15NH4+后,15NO2-的含量逐渐上升,表明AOA利用了15NH4+生成15NO2-,而在加入乙炔之后,15NO2-的生成逐渐停止而非立刻停止,这说明由NH3到NO2-的转化并非一步反应,其中间产物随时间减少。AB对照即可得出,羟胺为AOA氨氧化的中间产物。
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图7 A:底物为羟胺,虚线代表培养基中羟胺的浓度,对应左侧纵轴;实线表示含有同位素标记的羟胺浓度,对应右侧纵轴,横轴代表时间。B: 底物为NH4+,虚线代表培养基中亚硝酸盐浓度,对应左侧纵轴;实线代表含同位素标记的亚硝酸盐含量对应右侧纵轴,横轴代表时间。
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原标题:PNAS:羟胺是海洋中氨氧化古菌(Nitrosopumilus maritimus)氨氧化过程的中间产物6 E1 D  i8 H& F
作者:张翮, 杨玉春 微生物氮循环
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