厌氧氨氧化(Anammox)是指在厌氧或者缺氧条件下,厌氧氨氧化微生物以亚硝酸盐为电子受体,将氨氮氧化为成氮气的生物过程。据估计,全球约30%的海洋氮损失是由厌氧氨氧化造成。主导这一过程的微生物被称为厌氧氨氧化菌(AnAOB),是一类可以利用氨和亚硝酸盐进行生长的自养型微生物,广泛分布于海洋、淡水、陆地和各种极端缺氧环境。厌氧氨氧化菌(AnAOB)生长所需的亚硝酸盐依赖于氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)在好氧条件下氧化氨所提供。由于厌氧氨氧化过程受到氧气抑制,因此氨的好氧氧化和厌氧氧化之间存在微妙的氧平衡。前期的研究显示,氨和氧的亲和性在AOA/AOB竞争中起着至关重要的作用,同时也与AnAOB生态位分化关系密切,然而其对AOA/AOB与AnAOB在不同环境中的合作关系亦仍有待阐释。
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3 D( u) }" S6 N2 Z本研究使用了三株AOA菌株,分别来自美国俄亥俄州的Delaware湖(DW)和Acton湖(AC2)的富集物,以及从土壤中分离出的纯培养物(Nitrososphaera viennensis),所有试验菌株均属于Thaumarchaeota Group I.1a分支。基于氨单加氧酶基因(amoA)序列比较分析,AC2与DW的同源性为82%,N. viennensis与AC2和DW富集物的同源性分别为 70%和 71%。荷兰鹿特丹Sluisjesdijk污水处理厂提供了AnAOB颗粒污泥,该颗粒污泥是从Anammox反应器中进行收集,其Anammox的优势菌为Brocadia anammoxidans。所有培养物均在30℃条件下,在含有1mM 或2mM NH4Cl的Crenarchaeota培养基中生长。在N. viennensis的培养基中添加1mM 丙酮酸盐,在AnAOB培养基中添加1.3mM 或2.0mM NaNO2。9 |, [ t2 P, ]% v; Y
# S& Y# ?2 X) _% G) p/ Q, |结果
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DW AOA富集物的μmax、km,NH4、km,O2的结果如图1所示,AnAOB富集物的μmax、ki,O2的结果如图2所示。为了实现AOA和AnAOB之间的合作,需要与氧气(促进AOA /AOB和抑制AnAOB)和氨(供应给AOA /AOB和AnAOB)保持平衡。我们讨论了这种合作的两种可能情况:1. 微量需氧条件,当氧气浓度正好处于AOA活性被促进,同时AnAOB活性被抑制;2. 空间分离,即AOA/AOB产生的亚硝酸盐从好氧环境扩散到缺氧环境供AnAOB消耗利用。
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图1 DW AOA富集物的μmax、km,NH4、km,O2结果。图A为最大比生长速率(μmax; d−1);图B为氨的半饱和常数(km,NH4; mM);图C为氧的半饱和常数 (km,O2;mM)。利用亚硝酸盐的产生量确定图A的μmax (μmax= 0.41 d-1),耗氧量确定图B和图C的km(km,NH4=0.77μM; km,O2=3.6μM)。
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图2 AnAOB富集物的μmax、ki,O2结果。图A为最大比生长速率(μmax; d−1);图B为氧的抑制常数(ki,O2; mM)。利用亚硝酸盐的消耗量确定图A的μmax (μmax= 0.15d-1),用气体产量随压力的变化来确定图B的ki,O2(ki,O2=0.12μM)。
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与促进AOA和AnAOB生长的氨相反,氧抑制AnAOB并促进AOA的生长。因此,存在某一浓度的氧气,可以抑制AnAOB的活性同时促进AOA生长。图3为AOA的氧亲和力曲线(以μmax和km,O2)和AnAOB氧抑制曲线(以μmax和ki,O2),曲线的交点表示AOA以相同的速率生产亚硝酸盐,同时AnAOB正以同样速率消耗。% l& }! P0 i7 B5 j* s
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3 j8 J5 a6 U* O# t4 A3 ]图3 AOA平均氧亲和力曲线 (μmax= 0.36 d-1; km,O2=2.9μM)和AnAOB平均氧抑制曲线(μmax= 0.16 d-1; ki,O2=0.092μM)在0.32μM处有理想配合点(交点)。
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另外,当AOA产生的亚硝酸盐从好氧环境扩散到缺氧环境时,空间分离可以实现协同。为了说明好氧氨氧化和厌氧氨氧化的分离,图4显示了从同侧(共扩散)和相反侧(反扩散)供应氧气和氨的生物膜模拟结果。 K) q3 S2 |. o6 F/ Q; }& O5 [3 X
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图4 利用Aquasim软件建模比较对共扩散生物膜(左)和反扩散生物膜(右)通过短程硝化-厌氧氨氧化去除氨。AOB控制共扩散生物膜,而AOA控制反扩散生物膜。
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讨论
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2 F1 ]( N& I* U! O1 AOA动力学
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# V, T: [+ T8 [2 p& A! t本研究中的三株AOA菌株均具有大致相同的km,NH4和km,O2。km,NH4与先前报道的农田土壤中AOA富集物(km,NH4=0.69±0.04μM)相似,其中,主要AOA菌株为Candidatus Nirosoarchaeum koreensis MY1,与本试验中AC2的同源性为99.8%,与DW的同源性为81%。然而,本研究菌株的km,O2(km,O2≈2.9μM)高于MY1(km,O2=10.38±1.08μM)。这些结果进一步证实了AOA对氨的亲和力高于AOB(km,NH4范围为20~2000μM)。上述AOA中的km,NH4与报道的全程硝化(Comammox)菌的亲和性相当,然而同一篇文章报道的N.Vienensis的km,NH4明显高于我们的研究结果。从动力学的角度来看,Comammox和AOA应该竞争铵,未来的研究需要加强我们对其生态位分化的理解。
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& y: V {: p7 |" `3 O AOA富集物的μmax与French等(2012)测量值相似(≈0.38 d−1)。虽然两种富集物的测量μmax相近,但对于N.viennensis,其最大比生长速率明显较慢。一个可能的原因是,N.viennensis的最佳温度为35-37℃,而这些表征在30℃下进行。Tourna等(2011)也报道了N. viennensis的富集物生长良好,但纯培养物仅在添加丙酮酸时才生长。虽然本研究中的N.viennensis培养实验中添加了丙酮酸,但由于与其他微生物在浓缩培养中生长时消耗或供应的因素,丙酮酸仍然是有限的(与两种浓缩培养相比)。因此,考虑到所有三种AOA的其他测量参数具有高度相似性,N.viennensis的μmax可能更接近本研究中表征的DW和AC2菌株的μmax。! m% g0 i" b& v& ^
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虽然亲和性表征在确定生态位分化方面非常有用,但它不能作为绝对决定因素。如我们所示,参数测定存在变异性,其他环境条件,如温度、pH和群落因素在表观动力学参数中亦具有重要影响。AOA对氨的极强亲和性以及一些在酸性pH下生长的能力(其中铵是主要种类),已经推测它们的底物是铵而非氨。尽管最近的模型表明,大多数AOA的典型带电S层可以在氨氧化活性部位附近起到浓缩铵的作用,但目前还没有直接证据表明这两种物质都是底物。
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! O3 n3 ?; Q. C( d8 K8 f8 [6 q. [) P2 AnAOB动力学
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AnAOB的测量参数的重复之间的变异性通常高于AOA,这可能是由于以下原因:1. 相对不精确的活性测量;2. 由于AnAOB的聚集生长而增加的变异性;3. 群落复杂程度更高。尽管AnAOB颗粒污泥被分解,但是所得细胞倾向于再次絮凝/聚集并且更快地沉降,这可能导致培养物中的扩散限制。测量的亲和性与一些报道的值类似,其他研究报道氨和亚硝酸盐的亲和性更高。可能的解释是生态位分化与AnAOB菌株之间的亲和性差异有关。这种富集来自于一个污水处理厂,它接受非常高浓度的氨和亚硝酸盐,这可能选择了一个r-策略群体。相比之下,AnAOB在在寡营养环境中是活跃的,例如在海洋的缺氧区,将被认为采取具有更高亲和性的k-策略。尽管如此,AnAOB对氧的耐受性还是有限的,这表明在微嗜氧条件下其具有潜在的活性。文献报道μmax在30°C范围为0.0038 ~0.33 d−1,本研究结果同样处于这一范围内。类似于亲和性,不同AnAOB菌株μmax将根据他们所处环境的不同而有所不同。% ?0 ?$ z" @- e
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3 AnAOB与AOA/AOB的竞争/合作与数学建模# M. z) n2 i& f- a7 p
3 K! q: [1 j" h: c5 |: Q在评估AnAOB和AOA对氨的竞争时,很明显本研究中的AOA具有更高的亲和性。AOA的km值比报道的AnAOB的km值要低一个数量级。因此,在以氨为生长限制底物的寡养环境中,AOA很容易在氨的竞争中胜过AnAOB。另一方面,这些AOA和AnAOB之间的合作取决于AOA中的亚硝酸盐的产生和供应给AnAOB的未被AOA消耗的氨。因此,AOA对氨的氧化需要是部分的,产生亚硝酸盐但不消耗所有的氨。可以通过限制系统可用的氧气(图3)或通过AnAOB和AOA空间分离来促使这种合作(图4)。在氧饱和条件下,亚硝酸盐氧化细菌(NOB)将在亚硝酸盐的竞争中超过Anammox,但是这项研究将重点放在氧气限制的环境(例如海洋中的氧气最小区域),因此NOB没有被纳入到数学模型中。
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8 x$ b# o8 K% s/ T' _在生物膜环境中可能发生空间分离,例如在废水处理中,AOB消耗表面的氧和氨,而过量的氨和亚硝酸盐从AOB扩散到生物膜的低缺氧区域以供AnAOB消耗。然而,这取决于氨的供给量超过氧气,因此不会产生过量的亚硝酸盐。在营养浓度更低的环境中,这些生物膜将有利于AOA(或N. inopinata,显示出类似的高亲和力)超过AOB,但氧气需求将被显著限制,以允许氨扩散到AnAOB。另一方面,如果在生物膜的厌氧/缺氧侧提供氨,则AnAOB将优先获得氨。这就导致了这样一种情况,即AnAOB被提供更高浓度的氨,同时被氧气屏蔽并受亚硝酸盐限制,而AOA有更高浓度的氧气和有限浓度的氨,非常适合与AOB竞争。在传统的生物膜中,AOB/AOA是受氧气限制的。这种“交叉扩散”生物膜可以在AOA和Anammox之间形成类似于图3所示的微嗜氧环境更自然的协同作用。* q% }! E; V, m- s% M. l6 P8 x+ m
' P5 X& A+ D8 p2 j9 c* }* P% @从模拟结果来看,AOB在共扩散生物膜中占优势,而由于AnAOB产生的氨限制,较高亲和力AOA在反扩散生物膜中占主导地位。虽然可以模拟在共扩散情况下与AOA的协同作用,但通过对氨的限制,限制氨到达缺氧的AnAOB层,因此需要对氧和氨进行严格的调整,以适应这种协同作用。3 L8 C! `, L/ v
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尽管反扩散生物膜对全球氮循环可能并不重要,但在海洋水柱的大区域内也会出现类似的反扩散情况。以Lam等(2007)报道的黑海为例,氧从含氧地表水中向下扩散,而氨则从缺氧的底层海洋中从腐烂副产物向上扩散。这导致更深的海洋中表现出更高浓度的氨和更低浓度的氧水平,更有利于AnAOB;并且在上层海洋中有更低浓度和更高浓度的氧水平,对AOA更有利。淡水环境中存在相似的浓度梯度,表现出相似的种群响应,作者将这些环境中的合作归因于氧和氨的反扩散。由于低能脱氮的潜力,将Anammox系统应用于主流废水处理也是一个有意义的话题,然而实现低氮排放是一个挑战。已有的分析表明,在低氨浓度下,AOA富集应比AOB更有效,但是如果AOA和AnAOB存在于生物膜中,最理想的方案是提供氧气和氨反向扩散,以允许ANAOB活性(例如膜生物膜反应器);然而,普通的生物膜反应器(颗粒污泥基或移动床生物膜反应器)更难以控制。
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8 w" Q. V4 ^& {6 X8 ~9 m结论
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* v; z! n" i3 \" e: ^本研究中的亲和性结果与已发表的AOA和ANAOB的km/i值基本一致。然而,尚未确定的是亲和性对AOA/AnAOB合作的影响。由于AOA具有很高的亲和力,作者认为正是氧/氨反扩散环境促进了AOA/AnAOB的合作。为了进一步证明这一点,可以尝试在膜生物膜反应器中生长AOA和AnAOB,或者可以对短程硝化-厌氧氨氧化共存的环境中进行群落调查。此外,AOA和AnAOB的种类很多,其动力学尚未被充分研究,此项工作仍具有十分重要意义。
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原名:Affinity informs environmental cooperation between ammonia-oxidizing archaea (AOA) and anaerobic ammonia-oxidizing (Anammox) bacteria* o/ J Y5 Y4 H- w; Q+ }, @4 u
期刊:The ISME Journal,通信作者:Levi L. Straka7 `- h8 I+ p2 `- ` o
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