氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）在氮循环过程中扮演着重要角色，二者均可将氨（NH3）氧化为亚硝酸盐（NO2-）。羟胺是AOB氨氧化过程的重要中间产物，以欧洲亚硝化细菌（Nitrosomonas europaea）为例（图1），NH3被氨单加氧酶（AMO）氧化成羟胺，接着被羟胺氧化还原酶（HAO）氧化为亚硝酸盐。AOA的氨氧化底物和产物与AOB过程相同，但是AOA的基因组中没有编码HAO的基因，那么羟胺是否也是AOA氨氧化的中间物呢？2 k0 d7 i& l6 Y" \# p" N8 W
4 J8 z4 q0 k+ F* ^4 y
7 w& ~$ ], Y4 |6 T4 ]$ f
& f$ |* h- Y' A. T5 |3 I( \, a. L, j, T4 `2 x6 T( E' Y. }
图1 AMO: 氨单加氧酶；heme: 血红素；HAO: 羟胺氧化还原酶。/ I+ Y/ |( ~9 n# f& z: P
$ s) ^( Z% D; q由于羟胺不稳定，需要可靠的实验来证明这个假设。如果羟胺是AOA氨氧化的中间产物，则AOA一定可以氧化羟胺，那么给AOA培养基中加入羟胺之后，一定是有亚硝酸盐产生的。据此，Neeraja Vajrala等人做出如下对照实验：通过控制其它培养条件，在不同组的AOA培养基里分别加入50 μM、200 μM、1 mM的羟胺和200 μM的NH4+。如图2所示，以羟胺和NH4+为底物都有亚硝酸盐的产生。
. a* z( Z$ v P# _* p
/ Y* S' r- T( _6 O
5 Z% s6 n2 a' y2 w/ H" t/ o* f% A8 Z) X' ~
图2, g+ n6 Z4 |0 G' x3 ^1 H- }
7 @# ]$ V# c' u% P8 x5 W! S为了增加说服力，Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验：两个实验组的底物分别为200 μM的NH4+和200 μM的羟胺，然后统计两个实验组分别在加入0.1%的乙炔、2.5 mM的ATU（丙烯基硫脲）和空白对照条件下亚硝酸盐的生成量。结果如图3所示，0.1%的乙炔和2.5 mM的ATU都能有效抑制AMO的活性从而阻断NH4+氧化过程，但是AOA仍然可以氧化羟胺，说明羟胺的氧化过程与AMO的活性无关。, M. R. ~3 O4 A7 ^! e0 F( t+ C5 }& R: [: _
+ i- w* l3 G0 P3 ~ t
& m, N4 p; M& W/ g. l5 ]6 ~2 x, z
! l! |* Y. N! E' a2 I图3 带有正方形、三角形、圆形的曲线分别对应对照组、加入0.1%乙炔、加入2.5mM的ATU 横轴代表时间，纵轴代表培养基中亚硝酸盐浓度。! T7 Z' u: f# _ S& F2 e
; i5 [5 v/ g/ A% i综合上述两个实验可以确定AOA可以氧化羟胺，那此过程是否是其氨氧化的一部分呢？Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验，如图4所示，a为在ATU和乙炔存在的条件下加入NH4+和羟胺之后氧气的消耗情况，可以看到在只有NH4+作为底物时，氧气含量不变，在加入羟胺之后，氧气的含量呈线性下降。b为在NH4+存在的情况下加入ATU而后加入羟胺过程的氧气消耗，在加入ATU之前氧气含量呈线性下降，加入ATU之后，氧气含量不再变化，加入羟胺之后，氧气含量继续下降。该实验证明了AOA氧化羟胺需要氧气的参与。
+ M0 h* X- r V4 r+ ~8 o% h1 m$ ]7 x y) k) Z; C6 D( ~* `
. ~! D6 D0 G9 {- {$ ^图4 横轴代表时间，纵轴代表培养基中氧气浓度，箭头代表加入对应试剂。7 t# V9 D2 M8 ^: a+ n6 o
' W4 ]! g. m' I8 m% ^为了进一步验证羟胺的氧化是否与理论相符，Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验。如图5所示，羟胺消耗量:氧气消耗量:亚硝酸盐生成量近似等于1:1:1，实验结果表明AOA氧化羟胺的过程是与理论上的羟胺氧气氨三者的比例是吻合的。
* c/ u& o& A& B7 }0 e
% v7 B7 q8 V8 J) x4 d' z) C |为了验证羟胺的氧化与ATP的合成相关联，Neeraja Vajrala等人设计了另外一个实验，在培养体系中加入ATP合成抑制剂CCCP（氧化磷酸解偶联剂）。如图6所示，对比图6A和图6B，可以发现加入CCCP后底物为NH3的实验组几乎不产生亚硝酸盐，而底物为羟胺的实验组的亚硝酸盐生成量显著减少。此结果证明了羟胺的氧化与ATP的合成有关，换言之羟胺氧化是释放能量的过程。
0 c1 u1 X" Q5 u" q& n1 M* \! V9 M4 A* ~/ D
除此之外，该实验还有一个有意思的发现，对比图6A和图6B中活细胞实验组的ATP和亚硝酸盐的产生情况，生成等量亚硝酸盐时，底物为羟胺的培养基中的ATP含量远高于底物为NH3的培养基中的ATP含量，由此可以推断，氧化NH3到羟胺是消耗ATP的过程，而从图6B中加入CCCP和不加入CCCP亚硝酸盐的生成量不难看出， 在ATP顺利产生的情况下羟胺的氧化效率更高。/ [" F2 G$ F7 i7 }- ?6 \( {
) g5 K' P1 Y4 u# K7 Z
# i, B4 p! q4 |/ X8 h0 C- F1 A
$ o% v* m+ r" j$ P8 e' P
图5 正方形代表氧气吸收，对应左侧纵轴；圆形代表羟胺消耗，三角形代表亚硝酸盐生成，这二者对应右侧纵轴。横轴代表时间。
. c: E# B' P; W% q! J7 v
: `6 z9 H* M( l" C
4 Z# q) @) F& q. q; ^5 s( k4 D
, L+ l" o- v, s图6 白色为不加底物，灰色为加入NH4+作为底物，黑色为加入羟胺作为底物。横轴代表活细胞，加入CCCP的活细胞和加热杀死的细胞。A的纵轴代表培养基中ATP的含量，B的纵轴代表培养基中亚硝酸盐的含量。6 f; c5 z* q% R6 e3 F# Y
. i3 A* O0 J# [# i上述几个实验证明，类似于AOB，羟胺的氧化是AOA氨氧化过程的关键步骤，若是能证明AOA会将氨氧化为羟胺，则可以进一步证实羟胺是AOA氨氧化的中间物。1 Y! F; c# R0 |8 Z; }
# j- X3 @! d% F+ o6 S
采取实验的方法很难验证氨氧化生成成羟胺，首先因为羟胺的合成和转化同时进行，其次还因为羟胺氧化过程的酶在AOA中是未知的，无法有效阻断这一步酶催化过程。另外，羟胺非常不稳定，难以直接检测。于是Neeraja Vajrala等人采取了气相色谱法（GC）来分离物质，用同位素比质谱分析（IR-MS）的方法追踪氨氧化的中间产物。如图7A所示，加入15N标记的NH4+后，15NH2OH浓度逐渐上升，代表AOA在利用加入的15NH4+生成15NH2OH，而加入乙炔后，15NH2OH的浓度与羟胺的浓度呈相同的速率减少，这说明乙炔阻断了15NH4+到羟胺的转化。如图7B所示,加入15NH4+后，15NO2-的含量逐渐上升，表明AOA利用了15NH4+生成15NO2-，而在加入乙炔之后，15NO2-的生成逐渐停止而非立刻停止，这说明由NH3到NO2-的转化并非一步反应，其中间产物随时间减少。AB对照即可得出，羟胺为AOA氨氧化的中间产物。
) i4 L& X0 i! A! O
( e) _( f' v2 j. a+ d7 M
0 z/ E6 D7 Z9 N4 n& e6 {7 f
; F, i' p6 c2 m# e5 f图7 A:底物为羟胺，虚线代表培养基中羟胺的浓度,对应左侧纵轴；实线表示含有同位素标记的羟胺浓度，对应右侧纵轴，横轴代表时间。B: 底物为NH4+，虚线代表培养基中亚硝酸盐浓度，对应左侧纵轴；实线代表含同位素标记的亚硝酸盐含量对应右侧纵轴，横轴代表时间。* S/ t6 P/ s U1 P+ c& }8 f
% _! [2 E2 N4 n+ f* N& ?
$ f8 Y/ k3 y# s+ w( d原标题：PNAS：羟胺是海洋中氨氧化古菌（Nitrosopumilus maritimus）氨氧化过程的中间产物0 Z6 b4 E$ |1 c
作者：张翮， 杨玉春 微生物氮循环2 @+ N/ o6 a8 a3 z$ @+ w. a
/ }- C4 S, `: V |
© 声明：本文仅表作者或发布者个人观点，与环保之家[2TECH.CN]无关。其原创性及陈述文字、内容、数据及图片均未经证实，对本文及其全部或部分内容、图片、文字的真实性、完整性、及时性本站不作任何保证或承诺，仅做参考并自行核实。如有侵权,请联系我们处理,在此深表歉意。
|
![[报告]2021年世界水发展报告执行摘要 上篇](data/attachment/block/26/26edfcc068c2e848c8d8a8121831a5c9.jpg)
![[报告]2021年世界水发展报告执行摘要 下篇](data/attachment/block/21/215be821e512fdc16636ad656b4f7e23.jpg)
![[报告]2021年世界水发展报告执行摘要 上篇](data/attachment/block/8e/8e28e46df3c3a206beef50782485f88a.jpg)
[报告]2021年世界水发展报告执行摘要 上篇
深度：关于内回流，你应该知道的！
污泥热水解消化工艺的性能与成本解析
实践：化学氧化+化学还原/固化稳定化协同修
案例：广州京溪污水厂地下式MBR工艺应用
混凝澄清常用设施及调运