氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)在氮循环过程中扮演着重要角色,二者均可将氨(NH3)氧化为亚硝酸盐(NO2-)。羟胺是AOB氨氧化过程的重要中间产物,以欧洲亚硝化细菌(Nitrosomonas europaea)为例(图1),NH3被氨单加氧酶(AMO)氧化成羟胺,接着被羟胺氧化还原酶(HAO)氧化为亚硝酸盐。AOA的氨氧化底物和产物与AOB过程相同,但是AOA的基因组中没有编码HAO的基因,那么羟胺是否也是AOA氨氧化的中间物呢?/ S9 Q7 D x1 \2 j$ C
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3 z0 T! I2 c5 O8 F( a j图1 AMO: 氨单加氧酶;heme: 血红素;HAO: 羟胺氧化还原酶。 ( Z9 P9 J8 R* u1 V0 G3 E: @9 ~9 Q& V' t6 \% X! ~9 r; x
由于羟胺不稳定,需要可靠的实验来证明这个假设。如果羟胺是AOA氨氧化的中间产物,则AOA一定可以氧化羟胺,那么给AOA培养基中加入羟胺之后,一定是有亚硝酸盐产生的。据此,Neeraja Vajrala等人做出如下对照实验:通过控制其它培养条件,在不同组的AOA培养基里分别加入50 μM、200 μM、1 mM的羟胺和200 μM的NH4+。如图2所示,以羟胺和NH4+为底物都有亚硝酸盐的产生。 9 @ Y: v8 k$ r2 X 1 S- U( h; ~! k9 n; f6 W" ] " Y/ b" B' l3 i8 Q+ `" L( R( j9 k
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为了增加说服力,Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验:两个实验组的底物分别为200 μM的NH4+和200 μM的羟胺,然后统计两个实验组分别在加入0.1%的乙炔、2.5 mM的ATU(丙烯基硫脲)和空白对照条件下亚硝酸盐的生成量。结果如图3所示,0.1%的乙炔和2.5 mM的ATU都能有效抑制AMO的活性从而阻断NH4+氧化过程,但是AOA仍然可以氧化羟胺,说明羟胺的氧化过程与AMO的活性无关。 ; V/ D; Z* b8 ]! a4 p 5 Q7 I. E, ?! D! j. }5 D" @0 ?
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图3 带有正方形、三角形、圆形的曲线分别对应对照组、加入0.1%乙炔、加入2.5mM的ATU 横轴代表时间,纵轴代表培养基中亚硝酸盐浓度。4 v% d: u$ M6 ~5 O- J8 V' C. i- E
8 `4 D2 E7 x0 U2 F综合上述两个实验可以确定AOA可以氧化羟胺,那此过程是否是其氨氧化的一部分呢?Neeraja Vajrala等人设计了另一个实验,如图4所示,a为在ATU和乙炔存在的条件下加入NH4+和羟胺之后氧气的消耗情况,可以看到在只有NH4+作为底物时,氧气含量不变,在加入羟胺之后,氧气的含量呈线性下降。b为在NH4+存在的情况下加入ATU而后加入羟胺过程的氧气消耗,在加入ATU之前氧气含量呈线性下降,加入ATU之后,氧气含量不再变化,加入羟胺之后,氧气含量继续下降。该实验证明了AOA氧化羟胺需要氧气的参与。, Y$ @- b( {" t/ L; Y