工艺技术 精解：厌氧氨氧化菌

01

厌氧氨氧化菌的分类

厌氧氨氧化菌是厌氧氨氧化反应的功能之源。厌氧氨氧化菌是一类以氨和亚硝酸盐为基质的化能自养型微生物，属浮霉状菌门(phylum Planctomycetes )，已发现5属14种(如下表)。Brocadia , Kuenenia, Jettenia和Anammoxoglobus四属发现于污水处理厂等人工生态系统中；Scalindzza属发现于海洋或淡水等自然生态系统中。

表 目前发现的厌氧氨氧化菌

02

厌氧氨氧化菌的细胞结构和组成

厌氧氨氧化菌细胞多呈球形或卵形，直径0.8-1.1um。厌氧氨氧化菌的细胞内存在多重膜结构，这些膜结构将细胞由外到里分隔成三部分(如下图): 外室细胞质(paryphoplasm )、核糖细胞质(riboplasm)以及厌氧氨氧化体(Anammoxosome( van Niftrik et al., 2004; van Niftrik et al., 2008a; van Niftrik et al., 2013)。

最外层的外室细胞质类似于革兰氏阴性菌的细胞周质。

中间层的核糖细胞质中含有核糖体和拟核，大部分DNA存在于此。此外，核糖细胞质内还含有糖原颗粒和类聚经基脂肪酸醋颗粒(van Niftrik et al., 2008a; van Niftrik et al., 2008b)。

最里层的厌氧氨氧化体是一个细胞器，在厌氧氨氧化菌细胞分裂时可遗传给子代细胞。厌氧氨氧化体内存在厌氧氨氧化反应所需的多种关键酶，如类经氨氧化酶蛋白、联氨合成酶复合体、ATP合成酶等。

厌氧氨氧化菌不仅膜结构十分奇特，而且细胞膜的成分也非常特殊，其细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂。该阶梯烷膜脂由多个环丁烷或环己烷组成(Sinninghe Damste et al., 2005; Sinninghe Damste et al., 2002)。在各种厌氧氨氧化菌中，阶梯烷膜脂的含量基本相似。疏水的阶梯烷膜脂与亲水的胆碱磷酸、乙醇胺磷酸或甘油磷酸结合形成磷脂，构成细胞膜的骨架。阶梯烷膜脂具有较高的堆积密度使厌氧氨氧化菌的膜结构具有很高的不可透过性(Bouxnann et al., 2009 )。

图 厌氧氨氧化菌的细胞结构(a ),酶的免疫金定位((b)和阶梯烷膜脂(c)

03

厌氧氨氧化菌的分解代谢和合成代谢

厌氧氨氧化的经验反应式如下式1.1所示(Strous et al., 1998 )。这个反应包含
两个方面:
①分解代谢，NH4+和NO2-反应生成N2，并伴随能量产生(式1.2 )。
②合成代谢，CO2或HCO3-同化为细胞物质(式1.3)。

在厌氧氨氧化反应中，NO2-具有双重功能，一是作为厌氧氨氧化反应的电子受体，二是作为无机碳源固定的电子供体。



Strous等对厌氧氨化菌Candidatus Kuenen stuttgartiensis进行了宏塞因组图谱解析，并提出了厌氧氨氧化的分解代谢模型(图1.4所示)( Kartal et al., 2013; Strous et al., 2006 )。

在该模型中，厌氧氨氧化反应的中间产物是NO和N2H4，其氮素转化主要包括三个步骤( Kartal et al., 2010; Strous et al., 2006 ):

①在cdl型亚硝酸还原酶( nitrite reductase, Nir)的作用下，NO2-被还原成NO(式1.4 )。
②在联氨合成酶( hydrazine synthesis, HZS)的作用下，NO与NH4+缩合成N2H4(式1.5 )。
③在联氨水解酶( hydrazine dehydrogenase,  HDH)作用下，N2H4被分解为N2(式1.6 )。



ATP是生物体内的重要能量载体，与各种生命活动密切相关。大多数化能自养菌通过氧化磷酸化或底物水平磷酸化合成ATP。

厌氧氨氧化菌产能位点在厌氧氨氧化体内，所需能量来自NH4+和NO2-的反应。在厌氧氨氧化菌Candidatus Kuenen stuttgartiensis的基因组中，检出了编码电子传递链中氢醒、细胞色素c、细胞色素bcl复合体的基因(Strous et al., 2006 )。

据此推断，厌氧氨氧化菌的电子传递途径如图1.5所示，主要包括三个传递步骤:

①N2H4氧化释放的电子通过氢醒传递给细胞色素bc1复合体。
②细胞色素bc1复合体再将电子用于NO2-还原和N2H4合成。
③伴随电子传递，质子外排至厌氧氨氧化体膜外侧，并在膜两侧形成一定的质子梯度，进而驱动ATP合成。


图1.4厌氧氨氧化菌的分解代谢

注:bc1: bc1复合体; ETM:电子传递分子; HDH:联氨脱氢酶; Nir:亚硝酸氧还酶; HZS:联氨合成酶; Ψ,厌氧氨氧化体侧; Ψ-，核糖细胞质侧

自养型微生物进行碳素固定的途径主要有四种: 卡尔文循环(Calvin cycle) (Bassham et al., 1950 )、反向三梭酸循环(reverse tricarboxylic acid cycle ) ( Evans et al., 1966 )、还原性乙酞辅酶A途径(reductive acetyl CoA pathway,以下简称 acetyl CoA途径)( Ragsdale, 1991 )和3-基丙酸途径(3-hydroxypropionate pathway ) ( Berg et al., 2007 )。

厌氧氨氧化菌的合成代谢始于无机碳源的固定，其碳素途径为acetyl CoA途径(图1.5 )。

Schouten等通过同位素示踪法和酶活法推断，厌氧氨氧化菌的固碳方式为Calvin cycle或acetyl CoA途径(Schouten et al., 2004 )。

Strous等应用宏基因组技术对Candidatus Kuenen stuttgartiensis的基因组进行解析，发现其基因组中存在编码acetyl CoA途径关键酶的所有基因，而编码其他固碳途径的关键酶基因缺失或不完整，由此证实厌氧氨氧化菌通过acetyl CoA途径进行碳素固定(Strous et al., 2006)。

其次，在Candidatus Kuenenstuttgartiensis基因组中检出8个编码甲酸脱氢酶( formate dehydrogenase, FDH ) 的基因和5个编码一氧化碳脱氢酶( carbon monoxide dehydrogenase, CODH)的基因(FDH和CODH是acetyl CoA途径的关键酶)，并检测到FDH和CODH酶活，表明基因成功表达。此外，该基因组中还存在编码甲酞基四氢叶酸合成酶的基因。

由此推测，Candidates Kuenen stuttgartiensis的一碳代谢呈叶酸依赖型，而非甲烷蝶吟依赖型。在Candidates Kuenen stuttgartiensis墓因组中存在编码NADP氧还酶(复合体I) , NADH: Q氧还酶和甲酸: Q氧还酶复合体的墓因。由此推测，碳素固定的还原力来自NADH或QH2。


图1.5厌氧氨氧化菌的合成代谢

注:CODH:一氧化碳脱氢酶/乙酞辅酶A合成酶;  FDH:甲酸脱氢酶; HDH:联氨脱氢酶; Nuo: NADH:醒氧还酶(复合体I);Nxr:亚硝酸盐:硝酸氧还酶，CH3-H4F:甲基四氢叶酸

04

厌氧氨氧化菌的基质转运

自然环境内NH4+和N02-含量较低，而CO2和HCO3-含量充足。但是，无论含量高低，厌氧氨氧化菌需要吸收这些物质并将其运输到厌氧氨氧化体内才能进行分解代谢和合成代谢。

如图所示，和细菌一样，厌氧氨氧化菌拥有通道转运蛋白进行基质转运(Kartal et al., 2013 )。

其中，CO2可能依赖于细胞膜上的多肤蛋白，NH4+、NO2-和NO3-可能依赖于具有双向运输机制的主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily, MFS )。

NH4+、NO2-和NO3-的转运分别依赖于MFS蛋白中的AmtB/Rh蛋白、FocA/NirC蛋白以及NarK蛋白。


厌氧氨氧化菌的基质转运