工艺技术 解析：胞外电子传递-厌氧氨氧化菌氧化铵

厌氧氨氧化菌够通过胞内的电子受体（如NO2-或NO）将NH4+ 转化为N2，对地球氮循环贡献显著并在可持续污水处理领域发挥重要作用。然而，尚且不清楚其是否具有将电子转移至胞外不溶电子受体的胞外电子传递能力。因此，本文章研究表明淡水和海水中的厌氧氨氧化菌在氧化NH4+的过程中伴随着电子转移至胞外的不可溶电子受体（如氧化石墨烯或微生物电解池的电极）。15N标记实验表明NH4+ 被氧化为N2的过程经历了羟胺NH2OH作为中间产物；比较转录组学分析揭示了一种用电极作为电子受体的铵氧化替代途径；实现了NH4+ 完全氧化成N2没有NO2-和NO3- 的积累。胞外电子传递-厌氧氨氧化为氮的能效处理提供了希望。


铵氧化伴随胞外电子传递

富集培养三种系统进化和生理差别大的厌氧氨氧化菌，在氧化NH4+ 时以氧化石墨烯（GO）作为不可溶的胞外电子受体（理由是GO片比微生物细胞大，不会被微生物细胞内吞，因此其作为胞外电子受体被还原是通过胞外电子传递过程）。通过与无微生物的空白对照相比，只有在厌氧氨氧化菌存在的情况下GO被还原为rGO，溶液变黑；同时通过Raman表征细菌表面的GO被还原后，2D和D+D'峰的变化说明GO被还原为rGO。通过同位素标记15NH4+，分析厌氧氨氧化菌产生的30N2 随着培养时间的增长而增加，而29N2 的含量并没有变化，说明氨氧化过程中未标记的NO2-和NO3- 等没有最终参与生成N2，而且整个实验过程中未检测到NO和N2O等气体。



图1. 厌氧氨氧化菌氧化NH4+ 过程伴随着胞外电子传递还原GO为rGO


厌氧氨氧化菌的电活性

在单室多工作电极电解池中，通过计时电流测试厌氧氨氧化菌是否通过EET和电极作为唯一电子受体相互作用。1）非生物的空白体系中没有电流产生，NH4+ 也未被去除；2)在有生物的体系中，添加NH4+ 和NO2-没有电流产生，NH4+ 和NO2-完全去除；3）NO2-逐渐消耗至0 mM时电极作为唯一电子受体，厌氧氨氧化菌开始利用NH4+ 在电极表面形成生物膜；4）NO2-和NO3- 低于检测限，说明其没有明显作用；4）电流增加幅度与NH4+的浓度呈正比，在电极电势为0.6 V时电流最大，小于等于0.2 V时，电极表面无生物膜也没有电流产生。为了证明是厌氧氨氧化菌催化NH4+ 产生电流，进行了额外的空白对照实验：1）加入一种选择性抑制好氧NH3氧化剂ATU，它没有抑制NH4+ 的氧化和电流的产生；2）在MEC中的开路情况下 NH4+未被氧化，说明NH4+的氧化不是由电极引起的；3）添加NO2- 电流会立刻降低，同时NH4+ 和NO2-去除，NO3- 生成；4）反复添加NO2- 电流完全消失，说明厌氧氨氧化菌只有在没有外源性电子受体时，有电流产生；5）没有NH4+时无电流，再添加NH4+后电流恢复；6）高压灭菌MEC后立刻无电流，说明电流来自活的微生物。三种厌氧氨氧化菌的电化学测试结果类似，均具有以工作电极为电子受体氧化NH4+ 的电化学活性。

随后简单讨论了核黄素不影响其氧化还原性质，说明其直接电子传递机制；讨论双室和单室电解池，排除阴极析出H2反应影响；添加青霉素G而电流不变，并未说明什么问题。扫描电子显微镜表征了电极表面生物膜的形貌，在0.6 V时生物膜的细胞密度最大，在低于0.2 V时几乎没有微生物，这个结果与电流的大小一致。用特定的厌氧铵氧化探针原位荧光杂交和宏基因组分析了电极表面绝大部分的微生物为厌氧氨氧化菌，没有氨氧化细菌，与前面添加ATU不会抑制NH4+氧化的结果一致。



图2. 铵氧化伴随胞外电子传递


胞外电子传递-厌氧氨氧化过程的分子机制

典型的厌氧氨氧化过程以NO2- 为电子受体，NH4+被氧化为NH3：首先NO2- 还原成NO，随后与NH3产生肼，最终氧化成N2。




而在胞外电子传递的厌氧氨氧化过程，发现了短暂的联氨的累计之后产生羟胺NH2OH；NO牺牲剂PTIO并没有抑制效果，因此，假设该过程的中间产物是NH2OH而不是NO。通过同位素标记发现了新合成的15NH2OH，这与先前报道的电活性硝化微生物产生主要中间产物NH2OH类似；但是群落组成和氧化还原中值电位不同，说明氧化途径可能不同。NH2OH和NO都是联氨脱氢酶催化肼氧化的竞争抑制剂，但是尽管NH2OH引起了一定抑制作用，但是联氨脱氢酶仍然保持活性。通过比较转录组学分析电极表面的生物膜，电极替代NO2- 作为电子受体时，联氨脱氢酶是大多数上调基因的一种。而且，同位素标记15NH4+和D2H得到15NH2OD，说明微生物能利用水产生的OH-，而在非生物体系中没有检测NH2OD或NH2OH。据此，提出了胞外电子传递相关的厌氧氨氧化可能的机理。





图3. 与胞外电子传递相关的NH4+氧化的机理

比较转录组学分析结果：在电极作为电子受体时，基因编码的铵转载体（AmtB）、羟胺氧化酶和联氨脱氢酶大多数上调，这与MEC中氨氧化为氮气的趋势一致；基因编码NO和NO2- 还原酶（nir genes）和它们的氧化还原电对明显下调，与NO2- 不参与胞外电子传递-厌氧氨氧化过程一致，而且支持了NO不是中间生成物的结论；同位素标记说明NH2OH时中间产物而且不是由NO还原的，这与使NO还原为NH2OH的联肼水合酶（HZS）明显下调一致。有意思的是，联氨氧化产生的电子通过胞外电子传递途径转移至电极与金属还原菌Geobacter和Shewanella类似：细胞质的电子载体如NADH和铁氧化还原蛋白在细胞质膜被NADH 脱氢酶氧化，和/或甲酸脱氢酶直接还原细胞质膜内的甲基醌池高度表达。一种类似Shewanella的CymA细胞色素蛋白上调，氧化还原的甲基萘醌后，将电子转移至高度上调的周质细胞色素穿梭体，然后到外膜表面的孔蛋白，最终到胞外不溶电子受体。综合比较转录组学的分析结果，当NO2-换做工作电极作为电子受体，NH4+氧化存在一种与胞外电子传递相关的可选途径。



图4 胞外电子传递机制-厌氧氨氧化的分子机制

产电菌菌主之总结：这篇文章主要测试了厌氧氨氧化菌是具有胞外电子传递能力的电活性菌；结合同位素标记，发现了与胞外电子传递相关的NH4+氧化机理有羟胺中间体生成，与典型的氮氧化途径存在区别；结合比较转录组学的数据，验证了伴随NH4+氧化的胞外电子传递过程的分子机制。整体思路和方法并不难，但是能在机理方面提出新的观点不容易；胞外电子传递相关电化学实验讨论比较全面，甚至有些重复啰嗦，不晓得是否是为了给审稿人解释明白而添加的，但使用的电化学技术和展示的实验数据并不全面，仍有进一步研究的空间。另外，本文的supplementary information的讨论也值得关注。

来源：Nature Communications，原题目：Extracellular electron transfer-dependent anaerobic oxidation of ammonium by anammox bacteria，作者：Dario R. Shaw, Muhammad Ali, Krishna P. Katuri, Jeffrey A. Gralnick , Joachim Reimann, Rob Mesman , Laura van Niftrik , Mike S. M. Jetten, Pascal E. Saikaly