解析：厌氧氨氧化分子机制
Anammox和Denitrification是两个负责将N以N2的形式释放到大气中的微生物途径。Denitrification已有100多年的研究历史，其中间产物和相关用到的酶都已众所周知。尽管anammox是具有同等重要性的关键生物地球化学过程，但其分子机制未知，但有人提出是通过hydrazine（N2H4）实现anammox过程。本文中，作者解析了anammox的关键基因和蛋白，并纯化了催了hydrazine合成及其氧化为N2的关键酶。这些结果呈现了一个新的生化反应形成N-N键，这填补了我们对大气中N2的生化合成理解的空白。此外增强了NO在N循环过程中的作用。主要结果
Ammonium在没有分子氧的情况下很难被活化。因此anammox细菌是如何氧化ammonium并还原nitrite且形成N-N键生成N2？基于对Kuenenia stuttgartiensis（K菌）基因组的分析显示，提出一组涉及hydrazine和NO的3个氧化还原反应（等式1-3），来解释整体的anammox化学计量（等式4）。
在anammox过程中hydrazine的作用最初是基于发现当anammox细菌和和毫摩尔量的hydroxylamine一起孵育时hydrazine会暂时累积这样一个现象进行假设的。然而，hyrazine， hydroxylamine或NO的转换均未从实际的底物ammonium和nitrite开始，因此尚不清楚观察到的反应是anammox反应的组成部分还是副反应。
在膜反应器中富集了K菌。FISH实验显示K菌占据95%以上。RNA-seq显示97%的基因都进行了转录。宏蛋白组学捕获了1010个蛋白。同时进行了抑制剂和同位素标记研究，并通过液相色谱纯化后证实了酶复合物的活性。
图1. K菌的生化途径和酶机制
1 确定NO是中间产物
转录组和蛋白组表明K菌表达了cd1 nitrite::nitric oxide reductase可能还原nitrite到NO（nirS, 蛋白9%，6.3 fold mRNA覆盖）。当K菌和ammonium，nitrite一起孵育，加入NO（PTIO）时，发现anammox活性被抑制（图2a）。接着用ammonium和nitrite加DAF2-DA进行孵育，其中DAF2-DA会与NO反应并形成荧光产物。实验表明K菌发出绿色荧光（图2b）表明产生了NO。在对照实验中，不加nitrite或加入PTIO时检测不到荧光信号。需要注意的是PTIO和DAF2-DA都可能与除NO之外其他nitrogen monoxides例如nitroxyl（HNO）反应。但是与NO不同的是，HNO不是hydrazine酶的合适底物。
图2. 确定NO作为中间体
当加入acetylene（C2H2）时，anammox反应被抑制。acetylene通过与ammonia monooxygenase（aerobic ammonium oxidizers的ammonia活化酶）共价结合来抑制aerobic ammonium的氧化。显然，它干扰了ammonium活化的步骤（等式2）。重要的是acetylene抑制导致了中间产物NO的积累；但hydroxylamine没有积累，与NO作为hydrazine的直接前体的作用一致。
2 确定hydrazine是中间产物
接着，预测anammox途径的第二步是还原NO并同时与ammonium反应生成hydrazine（等式2）。由于尚未确定hydrazine在anammox分解代谢中的作用，所以作者首先证明了其在细胞中的反应（图3a，b）。为了探究是否可以直接从NO产生hydrazine，将K菌悬液与NO和ammonium一起孵育。观察到hydrazine的瞬间积累（18uM）（图3c），尽管与hydroxylamine一起孵育相比浓度要低得多（200-500uM）。这与等式1-3是一致的，因为所产生的hydrazine如预期的大部分氧化为N2，且根据等式5，NO的供给浓度可以更低。
图3.
3 确定hydrazine歧化产物
至此anammox将hydrazine氧化为N2的通路完整了（等式3）。很长一段时间，hydrazine都被认为是HAO基因的底物，HAO催化hydraxylamine转化为nitrite。K菌编码了10个HAO基因的同源体，其中6个在RNA和蛋白都高丰度。6个表达的同源体属于‘type II’ hydrazine/hydroxylamine oxidoreductases (HZO/HAO) 。2个与type II HZO/HAO有关的基因以及一个actahaem cytochrome c的表达水平很低，还有一个没有检测到表达。作者通过两步液相色谱法纯化了两个高表达的HZO/HAO蛋白（kustc0694 and kustc1061）。
这两种酶均以不同的速率以cytochrome c作为电子受体催化hydrazine到N2的四电子氧化。当将30N2H4和cytochrome c一起孵育，产出了30N2，这与等式3一致。有趣的是kustc1061也可以高速率的催化hydroxylamine为NO（而不是nitrite）。而kustc0694则不催化这个反应，且hydroxylamine和NO是hydrzine氧化的强大抑制剂，提示kustc0694是K菌专用的hydrazine dehydrogenase（HDH）。此外，kustc0694的抑制解释了在有hydroxylamine或NO的条件下hydrazine的瞬间累积。
4 确定产生hydrazine的机制
尽管尚没有酶能将NO和ammonium转化为hydrazine，但之前已经鉴定到两个潜在的基因簇，可能编码具有此功能的酶复合物（hydrazine synthase, HZS）。其中一个基因簇（kuste2859–61 ）编码了蛋白组中最高表达的蛋白（60%以上），且在转录组中也丰度极高（50-fold coverage）。而另外一个候选基因簇（kkuste2474-83，簇1）则转录水平低于平均值（1.7fold coverage，簇2），蛋白水平则没有检测到这个基因簇的产物。
簇1的蛋白纯化之后在变形的聚丙烯酰胺凝胶上跑出3条带，对应于三个联系的基因编码的多肽（kuste2859–2860–2861）。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示该复合物为约240kDa的多聚体。使用15N-ammonium和NO作为底物，在与kustc1061 HZO/HAO的耦合分析中显示了此复合物Hydrazine合成活性（图4）。在实验中，kustc1061通过将产生的hydrazine快速氧化为最终产物29N2来"pull"反应，同时通过提供用于hydrazine合成的电子来"push"反应（等式2和3）。Kustc1061单独无法催化这个反应，在缺少ammonium或NO的时候无法产生N2。在提供ammonium和hydroxylamine或nitroxyl（HNO）作为底物时，也没有产生N2（hydroxylamine不是可以转化为nitrite/NO吗，理论上会有N2？）。
在藕联实验中，N2的形成活性为20 nmol/h mg/protein，低于含有ammonium和nitrite的全细胞的活性（约1800 nmol/h mg/protein）。细胞提取物不能从ammonium和nitrite生成N2，但可以在相同条件下从NO和ammonium形成N2，其速率比纯化的HZS低六倍（3.4 nmol/h mg/protein）。这样的细胞提取物破坏了细胞后活性降低最可能是由于以hydrazine合成为限速步骤的紧密耦合多组分系统的破坏。
图4. hydrazine合酶复合物和kustc1061从15NH4和NO生成29N2
5 确定HZS和HDH的必须性
有趣的是kuste2859-61复合物可以独自从ammonium和NO生成N2（图4）。纯化的酶以特定的活性34 nmol/min mg/protein 氧化Hydrazine为N2，导致整体歧化反应（等式5）。考虑到hydrazine是anammox代谢的能量来源，HZS形成N2的过程将低产。因此，作者推测，anammox细菌可能有备用机制，可以有效的捕获hydrazine，并以低浓度将（N）抑制性化合物（例如NO和hydroxylamine）保持在低浓度，这可以部分解释HAO/HZO蛋白在基因组中的冗余性。所以本文实验表明，HZS和HDH是必须的，且能够从底物ammonium和中间体NO生成N2。
6 解析anammox的机制
综上所述，anammox分解代谢和生长能量必须通过三个反应（等式1-3）来保存。假设anammox细菌通过膜结合的ATP合酶复合物来合成ATP，该酶复合物是由proton-motive force(pmf)驱动，而pmf是由分解代谢反应在quinol::cytochrome c oxidoreducase system ( complex III, the bc1 complex）产生。
有意思的是，K菌中找到了3个基因簇编码bc1复合物，以及4个基因簇编码ATP合酶。其中一个的表达高于其余2个。当在K菌悬浮液中加入pentachlorophenol（quinol的结构类似物，且是已知的bc1复合物的抑制剂）时，anammox活性被完全抑制，提示bc1复合物参与了能量保存，并且其在从hydrazine氧化到nitrite还原和hydrazine合成的电子传输中的作用，K菌基因组没有任何其他的备份。而4个编码ATP合酶的基因簇的表达则更加不对称。其中一个簇（kuste3789–96）蛋白组丰度14-58%，而其他3个的丰度低于1%，mRNA的覆盖率也相差六倍。近期研究表明，编码表达最高的ATP合酶的催化性的b-亚基的基因产物与厌氧生物体细胞内细胞室的膜相关，提示它是proton-motive机制的位点。
本文通过实验确定了NO和hydrazine作为厌氧氨氧化的中间产物。纯化了由基因簇kuste2859-61编码的高表达蛋白，并证明了可以从NO和ammonium形成的N-N键。hydrazine合酶和denitrifiers的NO还原酶能够将两个N原子结合在一起。与NO还原酶相反，hydrazine合酶结合了两个不同的含N分子。而大气中的N2都是由NO的氧化能力形成，这可能说明，NO是地球上第一个deep redox sink。期刊：Nature 作者：Boran Kartal等，Radboud University，水与湿地研究所微生物系
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